S-nitrosylaatio

S-nitrosylaatio on soluissa tapahtuva biokemiallinen reaktio, jossa tiettyjen kysteiinien tioliryhmiin liitetään typpioksidiryhmä. S-nitrosylaation häiriöitä on epäilty osallisiksi moniin sairauksiin.

Typpioksidi ja typpioksidisyntaasit

Typpioksidi on kaasumainen yhdiste ja tärkeä signaali- ja säätelymolekyyli. Sillä on lukuisia tehtäviä normaalissa fysiologiassa sekä luultavasti monissa patofysiologisissa tiloissa. Typpioksidi diffundoituu sangen vapaasti ja läpäisee hyvin biologisia kalvoja, joskin sen lyhyt elinikä rajoittaa sen vaikutuslaajuutta. Biologisesti vaikuttavat pitoisuudet ovat pieniä, mikromoolien luokkaa.

Endogeenista typpioksidia muodostavat typpioksidisyntaasit (NOS), joita nisäkkäillä on ainakin kolmea eri isoentsyymiä. NOS1 eli neuronaalinen NOS sekä NOS3 eli endoteliaalinen NOS ovat konstitutiivisia eli jatkuvasti ilmentyviä entsyymejä. Niitä esiintyy vaihtelevia määriä hermostossa ja endoteelisoluissa, joskin myös muualla. NOS2 eli indusoituva NOS on muun muassa makrofageissa ilmenevä isoentsyymi, joka aktivoituu esimerkiksi sytokiinien vaikutuksesta. Isoentsyymit eroavat toisistaan jossain määrin, mutta merkittävimmin ero konstitutiivisten ja indusoitavien entsyymien välillä, vaikka toisinaan myös NOS2 voi olla jatkuvasti ilmentyvä. Kaikki isoentsyymit valmistavat typpioksidia L-arginiinista. Reaktio vaatii myös molekulaarista happea ja NADPH:ta.

Yleistä S-nitrosylaatiosta

Kysteiinin rakennekaava

Proteiinien tiettyjen kysteiinitähteiden tioliryhmään kovalenttisesti liitetyn typpioksidiryhmän on ymmärretty olevan tärkeä, tarkkaan säädelty translaationjälkeinen hapetus-pelkistystyyppinen proteiinimuokkaus, jolla on muun muassa merkittäviä säätelyyn liittyviä tehtäviä.

Proteiinien kysteiiniaminohappojen S-nitrosylaatiossa muodostuneilla S-nitrosotioleilla (RSNO) arvellaan olevan monia vaikutuksia esimerkiksi signaalinsiirrossa, DNA:n korjauksessa, immuunipuolustuksessa, verenpaineen säätelyssä, ionikanavien säätelyssä ja hermosignaalien välityksessä. Erilaisten S-nitrosotiolien arvellaan myös toimivan jonkinlaisena typpioksidivarantona solunsisäisille ja -ulkoisille tiloille. RSNO:t ovat typpioksidia pysyvämpiä yhdisteitä ja S-nitrosylaation arvellaan nykyisin välittävän suuren osan typpioksidin vaikutuksista. Proteiinin S-nitrosylaatio voi myös lisätä tai vähentää disulfidisiltojen muodostusta. Lisääntynyt NOS-aktiivisuus lisää S-nitrosylaatiota. Endogeeninen S-nitrosylaatio näyttää siis olevan vahvasti kytketty NOS-signalointiin.

Nitrosyloivat molekyylit ja nitrosylaatioon vaikuttavat tekijät

Toistaiseksi on vielä hieman epäselvää, muodostuvatko RSNO:t suoraan NOS:ien tuottamasta typpioksidista vai muodostavatko typpioksidisyntaasit muita(kin) nitrosyloivia molekyylejä. Sekin on epäselvää, liitetäänkö typpioksidi suoraan kysteiinin tioliryhmään entsymaattisesti vai vastaavatko muut nitrosyloivat molekyylit S-nitrosotiolien muodostumisesta. Molempien voisi olettaa tapahtuvan ympäröivistä olosuhteista riippuen. Luultavaa kuitenkin on, että NOS:ien syntetisoima typpioksidi muodostaa tehokkaampia nitrosyloivia molekyylejä, kuten typen muut korkeammat oksidit (NO₂, N₂O₃), peroksinitriitti ja siirtymämetalli-typpioksidiadduktit. Myös S-nitrosoglutationi (GSNO) voi siirtää NO-ryhmän proteiinin kysteiinitähteelle. GSNO on vallitseva ei-proteiinien S-nitrosotioli soluissa ja solujen ulkoisessa nesteessä ja se toimii tasapainossa proteiini SNO:iden kanssa. Eri nitrosyloivien molekyylien muodostus riippuu typpioksidin ja muiden rekursorimolekyylien konsentraatioista, sijainnista sekä muista ympäröivistä olosuhteista.

Nitrosylaatiolle ei ole yhtä yleistä reaktiomekanismia, vaan molekyylitasolla nitrosylaatioon vaikuttaa paljon se, minkälainen peptidi tai proteiini ollaan nitrosyloimassa. Nitrosylaatiomekanismi voi myös muuttua reagenssien pitoisuuksien tai systeemin hapetus-pelkistystilan mukaan. Proteiinin nitrosylaatioon vaikuttavat ennen kaikkea neljä tekijää: Biologisesti merkittävien nitrosyloivien reagenssien muodostus, niiden etäisyys sopivasta nitrosyloitavasta kysteiinin tiolista, tämän tioliryhmän saavutettavuus ja taipumus tulla nitrosyloiduksi sekä tietenkin denitrosylaation teho.

Hydrofobisen ympäristön on arveltu suosivan nitrosylaatiota. Oletusta tukee se, että sekä typpioksidi että molekulaarinen happi (ja NO + O₂ → N₂O₃ ) viihtyvät paremmin lipofiilisessä ympäristössä.

Monissa S-nitrosyloitavissa proteiineissa on havaittu happaman ja emäksisen aminohapon sijaitsevan kohdekysteiinin läheisyydessä. Ne voivat osaltaan vaikuttaa tioliryhmän mikroympäristöön ja pKa:han.

Myös NO-ryhmän donorin ja akseptorin oikea orientaatio toisiinsa nähden on tärkeä S-nitrosylaation spesifisyyttä määrittävä tekijä. Kohdeproteiinin allosteerinen säätely voi vaikuttaa kohdekysteiinin saavutettavuuteen tai mikroympäristöön ja näin se yllä mainittujen tekijöiden lisänä tarjoaa keinoja säädellä proteiinin S-nitrosylaatiota, typpioksidiryhmän siirtoa toisille tioliryhmille sekä denitrosylaatiota.

Denitrosylaation arvellaan tapahtuvan pääasiassa pelkistävillä mekanismeilla ja ryhmän siirrolla. GSH tai muut solunsisäiset tioliryhmät ja tietysti muiden proteiinien kysteiinitähteet voivat toimia NO-ryhmän akseptoreina transnitrosylaatiossa. Myös valo, askorbaatti ja metalli-ionit, varsinkin Cu(I), voivat vaikuttaa S-NO proteiinien hajotukseen.

Esimerkkejä S-nitrosylaation vaikutuksista

Typpioksidi tunnetaan vasodilatoivana signaalimolekyylinä. Hemoglobiini sitoo happea sitoessaan typpioksidia kysteiini 93:een, jonka se vapauttaa vähähappisemmissa oloissa. Tämä NO-välitteinen vasodilataatio edesauttaa kudosten hapensaantia.

Konstitutiivisesti ilmenevän NOS:in apoptoottiset estävät vaikutukset välittyvät mahdollisesti kaspaasi(e)n S-nitrosylaatiovälitteisellä inhibitiolla. Kun aktiivisen kohdan kysteiini on jatkuvasti S-nitrosyloitu, on kaspaasi inhiboitu. Denitrosylaation seurauksena entsyymi aktivoituu.

NMDA-glutamaattireseptori päästää avautuessaan kalsiumioneja virtaamaan soluun. Sisään virtaava kalsium taas on neuronaalisen NOS:in pääasiallinen säätelijä. NMDA-reseptori puolestaan on S-nitrosylaation kohde. S-nitrosylaatio inhiboi NMDA-reseptoria eli vähentää sisään virtaavan kalsiumin määrää. S-nitrosylaation on arveltu myös vaikuttavan reseptorin desensitaatioon lisäämällä sen herkkyyttä Zn²⁺:n välittämälle inhibitiolle.

S-nitrosylaation häiriöitä on epäilty myös osallisiksi moniin sairauksiin. Tiettyjen kysteiinitähteiden muokkauksen arvellaan olevan mahdollisesti merkittäviä joissain autoimmuuni- ja infektiosairauksissa. Tähän viittaa S-nitrosokysteiiniä vastaan muodostettujen vasta-aineiden havaitseminen esimerkiksi joillain multippeliskleroosia sairastavilla potilailla. Muita sairauksia, joihin on liitetty mahdollisia S-nitrosylaation häiriöitä, ovat mm. Parkinsonin tauti, sirppisoluanemia, kystinen fibroosi, astma, artriitti, diabetes ja hyperkolesterolemia.

Lähteet

• M.-C. Brolliet: S-nitrosylation of proteins, Cellular and Molecular Life Siences 1999
• Matthew W.Foster, Timothy J. McMahon and Jonathan S. Stamler : S- nitrosylation in health and disease , Trends in Molecular Medicine Vol.9 No.4 April 2003
• Douglas T. Hess, Akio Masumoto, Sung-Oog Kim, Harvey E. Marshal and Jonathan S. Stamler; Protein S- nitrosylation: Purview and parametres , Nature Vol.6 February 2005
• Paul Lane , Gang Hao and Steven S. Gross: S- nitrosylation is Emergin as a Spesific and Fundamental Posttranslational Protein Modification : Head-to-head Comparison with OPhosphorylation Science's stke 2001