Massaspektrometria proteiinianalytiikassa

Massaspektrometriaa käytetään laajalti proteiinien tunnistamiseen, tuntemattoman proteiinin rakenteen ja moolimassan selvittämiseen sekä sen kvantitoimiseen. Yleisesti puhutaan proteomiikasta. Massaspektrometriassa mitataan näytemolekyylin molekyylimassa. Proteiinit ovat rakentuneet 20 aminohaposta, mutta muodostavat aminohappojen järjestyksen ja määrän vaihtelun avulla kymmenien tuhansien erilaisten yhdisteiden eli molekyylien joukon. Proteiinien molekyylimassa vaihtelee aminohappoketjun pituuden mukaan muutamasta sadasta Daltonista (atomimassayksikkö) jopa miljooniin. Massaspektrometreillä voidaan instrumentista riippuen analysoida kymmenien tuhansien daltoneiden painoisia proteiineja. Analyysin tehostamiseksi massaspektrometria syöttää kuitenkin usein nanovirtaus-nestekromatografia (HPLC)-laitteisto. HPLC-tekniikka rajoittaa HPLC-massaspektrometri (LC-MS) -laitteiston käytännön molekyylimassa-alueen peptidi/proteiini analytiikassa alueelle 300–8 000 Da.

Kaikissa massaspektrometreissa mitattavat molekyylit on saatava kaasufaasiin, sekä lähes aina myös varattua, eli molekyylin täytyy olla ionimuodossa. Toisin sanoen ennen analyysiä proteiinit tai peptidit eli proteiinien osat, täytyy ionisoida. Ionisointiin kaksi yleisintä tapaa ovat elektronisuihkuionisaatio (engl. electrospray ionisation ESI) ja matriisiavusteinen laserdesorptioionisaatio (matrix-assisted laser desorption/ionisation, MALDI). ESI voi muodostaa myös moninkertaisesti varautuneita ioneja. Proteiinianalytiikkaan eli proteomiikkaan soveltuvat periaatteessa kaikki massaspektrometrityypit, mutta analyysin tehokkuus riippuu siitä kuinka nopeasti laite pystyy tekemään luotettavan tunnistuksen analysoitavana olevasta peptidistä, proteiinin osasta. Kun näytemolekyyli, proteomiikassa peptidi, on saatu kaasufaasiin, sen massa voidaan yrittää analysoida. Massaspektrometrissa on siis oltava vähintään ionisaattori ja analysaattori.

Analysaattorit

Analysaattoreita on erilaisia, mm. lentoaika-analysaattori eli TOF (time of flight): muodostaa ioneille saman kineettisen energian viemällä ne sähkökentän läpi ja mittaa ajan, joka kuluu detektorille pääsyssä, kvadrupolianalysaattori (quadrupole): käyttää oskilloivaa sähkökenttää selektiivisesti stabiloidakseen tai destabiloidakseen ioneja, jotka kulkevat kentän läpi, ioniloukku eli QIT (ion trap): sama periaate kuin kvardupoli-MS:ssä, mutta ioneja kerääntyy laitteeseen tietyksi ajaksi, lineaarinen ioniloukku eli LIT (linear ion trap): ionit kerääntyvät 2D-kvadrupolikenttään 3D:n sijaan, Fourier-muunnos-ionisyklotroniresonanssi eli FT-ICR (Fourier transform ion cyclotron resonance): mittaa magneettikentän läsnä ollessa syklotronoivien ionien muodostaman virran.

Määritys

Proteiinin moolimassan määrityksessä on yleisesti kaksi tapaa: koko proteiinin ionisointi (ESI tai MALDI) → useimmiten TOF- tai FT-ICR-analyysi, tai proteiinien entsymaattinen pilkkominen pienemmiksi peptideiksi (trypsiini, pepsiini, muut proteolyyttiset entsyymit jne.) ennen massa-analyysiä. ”Bottom-up” approach. Yleisin instrumentti peptidien massa-analyysissä QIT. Proteeinin tunnistuksessa voidaan käyttää mm. Peptide mass fingerprinting -metodia, jossa proteolyyttisten peptidien massoja verrataan tietokantaan, jossa löytyy ennustuksia fragmenteista, jotka syntyvät tunnettujen proteiinien pilkkoutuessa. Jos vastaavuus on riittävän suuri, voidaan olettaa että näytteessä löytyy kyseistä proteiinia. Toinen tapa on tandem MS, joka sisältää useita vaiheita joiden välissä usein fragmentaatio.

1. MS voi eristää peptidin,
2. MS stabiloi peptidi-ionia sen törmätessä kaasumolekyyleihin, jolloin ne hajoavat (CID, collision induced dissociation),
3. MS analysoi syntyvät fragmentit.

Kierto alusta jollain toisella peptidillä, kunnes kaikki proteiinin peptidit käyty läpi. Peptidit katkeavat useimmiten peptidisidoksista → massoja voidaan verrata tietokantaan peptidijaksoista → ah-järjestys selville.

Kvantifionti

Proteiineja voidaan kvantifioida tuomalla vakaita raskaampia isotooppeja (C13, N15) yhteen näytteeseen, toiseen näytteeseen kevyet isotoopit (C12, N14). Näytteet sekoitetaan ennen massa-analyysiä. Näytteet eroavat spektrissä massaerojen perusteella. Huippujen intensiteettien suhde vastaa peptidien suhteellista runsautta. Post-translationaalisten modifikaatioiden selvittäminen on myös yleinen MS:an sovellutus.

Aiheesta muualla

• Suomen Massaspektrometrian Seura (Arkistoitu – Internet Archive)